Новейший способ реминерализации эмали с помощью высокоинтенсивного фокусированного ультразвука

Реминерализация является важнейшей интервенционной стратегией для предотвращения белых пятен эмали (БПЭ). Учитывая ограничения как естественных, так и/или фторид-опосредованных процессов восстановления, существует необходимость в разработке новых стратегий восстановления БПЭ с помощью минимально инвазивного подхода, восстанавливающего уникальную ультраструктурную целостность и функциональные свойства. Вдохновленные уникальной способностью высокоинтенсивного фокусированного ультразвука (high-intensity focused ultrasound; HIFU) ускорять процесс кристаллизации, мы предлагаем новую стратегию использования HIFU для восстановления БПЭ in vitro посредством синергии процесса кристаллизации, необходимого для образования гидроксиапатита (ГАП) из его предшественника (кластеров ионов фосфата кальция; КФИК).

После разработки и характеризации КФИК, включая полученный аморфный фосфат кальция (AФК), было исследовано влияние HIFU на переход AФК в ГАП на аморфной подложке с помощью просвечивающей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения, электронной дифракции выбранной области и рентгеновской дифракции (X-ray diffraction, XRD). Результаты показали глубокий аморфно-кристаллический фазовый переход в течение 5–30 минут воздействия HIFU.

.Для восстановления эмали искусственные БЭП были созданы на образцах эмали, после чего следовало воздействие HIFU в течение 2,5, 5 или 10 минут. Сканирующая электронная и атомно-силовая микроскопия выявила уменьшение шероховатости поверхности и постепенное стирание пористой структуры БПЭ с непрерывным линейным коаксиальным расположением кристаллитов ГАП, заполняющих призматические/межпризматические зазоры, очень напоминающие здоровую эмаль, особенно при 5-минутном воздействии HIFU. Ультраструктурное восстановление эмали БПЭ было дополнительно подтверждено с помощью спектрального анализа XRD  с соответствующим восстановлением минеральной плотности и наномеханических свойств, что отражено результатами микрокомпьютерной томографии (КТ). Микро-КТ дополнительно подтвердила подповерхностную реминерализацию БПЭ с воздействием HIFU. При тех же параметрах воздействия HIFU продемонстрировал мощный антибиопленочный эффект против Streptococcus mutans. В этом исследовании был представлен новый подход к реминерализации эмали БПЭ посредством мощной синергии между HIFU и КФИК.

В минимально инвазивной стоматологии реминерализация является важной стратегией для лечения ранних кариозных поражений. Хотя слюна способствует естественной реминерализации, ее эффективность после поражения белым пятном была поставлена под сомнение. В связи с этим в качестве профилактического подхода была предложена фторид-опосредованная реминерализация. Тем не менее, существует повышенный риск токсичности, связанной с фторидом, при потреблении фторида из нескольких источников. Более того, исследования показали, что фторид-опосредованная реминерализация ухудшает механические свойства восстановленной эмали, поскольку она не способна образовывать упорядоченные минеральные кристаллы. Во-вторых, образование фторапатита препятствует диффузии ионов минералов в более глубокие области поражения, что приводит к неполной реминерализации эмали. Учитывая ограничения как естественных, так и фторид-опосредованных процессов восстановления, существует необходимость в разработке новых стратегий восстановления зубной эмали с использованием минимально инвазивного подхода, восстанавливающего уникальную ультраструктурную целостность и функциональные свойства.

Исследователи активно изучают инновационные методы реминерализации ранних стадий деминерализации эмали, такие как образование гидроксиапатита (ГАП) из наночастиц аморфного фосфата кальция (АФК) в качестве предшественника, минерализация, вызванная белками/пептидами, и реминерализация, вызванная гидрогелем. Однако эти подходы реализуются в строгих условиях, включая высокие температуру и давление, низкий pH, технические сложности и/или высокую стоимость, что может ограничить их широкое применение в клинической практике.

Стоит отметить, что кристаллиты ГАП в естественной эмали происходят из предшественников AФК, в частности, состоящих из кластеров Познера (Ca9 _[ PO4 _] 6 ₎ , которые представляют собой ионные кластеры с размером домена приблизительно 0,95 нм). Поэтому кластеры ионов фосфата кальция (КФИК) были предложены в качестве границы минерализации для реминерализации эмали. Несмотря на демонстрацию эпитаксиального роста, восстановление эмали с помощью КФИК может быть клинически нежизнеспособным, поскольку метод кристаллизации требует приблизительно 48 часов инкубации в контролируемых условиях. Кроме того, этот подход был исследован только для восстановления деминерализованных фосфорной кислотой поражений в качестве учебной модели, которая не имитировала фактические ранние кариозные поражения эмали.

Высокоинтенсивный сфокусированный ультразвук (HIFU) привлек широкое внимание в медицине и стоматологии как перспективный терапевтический метод из-за его уникального взаимодействия с биологическими тканями и антимикробных свойств без лекарств. HIFU представляет собой интенсивную сфокусированную ультразвуковую энергию, способную генерировать акустическую кавитацию, что приводит как к физическим эффектам (таким как ударные волны и высокоскоростные микроструи), так и к химическим эффектам (таким как образование видов свободных радикалов). Сообщалось, что эти свойства ускоряют процессы кристаллизации, контролируя размер и форму синтезированных наночастиц. Кроме того, сонохимические методы показали себя как многообещающие подходы для синтеза наночастиц ГАП из-за их способности усиливать процесс зародышеобразования, сокращать время кристаллизации. Вдохновленные уникальной способностью HIFU в облегчении процесса кристаллизации с сопутствующим потенциалом безлекарственной антибактериальной пленки, в данной работе предлагают новую стратегию, основанную на концепции использования HIFU для синергии восстановления in vitro БПЭ эмали после нанесения КФИК (рис. 1). Поэтому первой целью является оценка влияния воздействия HIFU на трансформацию некристаллического АФК в кристаллические наночастицы ГАП. Второй целью является исследование синергетического эффекта HIFU и КФИК на восстановление образцов эмали, содержащих искусственные БПЭ. Конечной целью является оценка антибиопленочного эффекта HIFU против кариесогенных бактериальных биопленок, прикрепленных к поверхности эмали.

Экспериментальная установка HIFU

Установка HIFU состоит из чашеобразного пьезоэлектрического керамического преобразователя (H-115; Sonic Concepts) с резонансной частотой 250 кГц, работающего при мощности 30 Вт (непрерывный режим), соединённого с поликарбонатным контактным конусом (C-101, Sonic Concepts; рис. 2). Контактный конус (содержащий дегазированную воду) использовался для синхронизации и передачи сфокусированных волн на образцы.

Потенциал кристаллизации HIFU

Было исследовано влияние HIFU на переход АФК в ГАП на аморфных стеклянных подложках. В стеклянные флаконы, содержащие наночастицы АФК, полученные из КФИК, добавляли дистиллированную воду. Каждый флакон помещали в фокус и подвергали воздействию HIFU в течение различной продолжительности (от 2,5 до 30 мин). Образовавшийся ГАП исследовали с помощью рентгеновского дифрактометра (Malvern Panalytical) в диапазоне 2θ. Наночастицы ГАП анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии с энергодисперсионной спектроскопией (ПЭМ-ЭДС), электронной дифракции в выбранной области и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения.

Синергетический эффект HIFU и CPIC на восстановление БПЭ эмали

Для исследования были использованы премоляры человека (N = 140) после получения одобрения этического комитета. Образцы эмали были подготовлены с губных поверхностей (4×3×3 мм) с помощью низкоскоростной алмазной пилы и отполированы дисками из карбида кремния с восходящей зернистостью в условиях водяного охлаждения, после чего обработаны ультразвуком в течение 5 минут в дистиллированной воде. Были созданы искусственные БПЭ и распределены по 5 экспериментальным группам: воздействие HIFU без наночастиц КФИК (HIFU/-NP), наночастицы КФИК без воздействия HIFU (NP/-HIFU) или наночастицы КФИК с последующим воздействием HIFU в течение 2,5 мин (NP/HIFU [2,5 мин]), 5 мин (NP/HIFU [5 мин]) или 10 мин (NP/HIFU [(10 мин]).

Морфологию поверхности эмали исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Сканирование с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) проводили в полуконтактном режиме при 25 × 25 мкм, после чего рассчитывали шероховатость поверхности (S_a). Пики рентгеновской дифракции (XRD) образцов эмали с БПЭ сначала регистрировали в диапазоне 2θ. Образцы эмали, обработанные КФИК до и после воздействия HIFU, перекодировали для исследования любых кристаллографических изменений. Анализ минерального состава проводили с помощью рамановской микроскопии.

Для оценки минеральной плотности и глубины поражения образцы эмали сканировались с помощью микрокомпьютерной томографии. Для расчета минеральной плотности фантом в единицах Хаунсфилда (HU) калибровался с использованием той же трубки (заполненной водой; водный фантом). Значения HU для воздуха и воды были приняты равными -1000 и 0 соответственно для калибровки шкалы HU в программном обеспечении CTAn. После этого минеральная плотность оценивалась из набора проекционных данных, в котором области интереса выбирались из 3 различных участков БПЭ. Глубина поражения дополнительно измерялась по тем же срезам областей интереса.

Эффект антибиопленки HIFU

Эффект антибиопленки против Streptococcus mutans оценивали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM; Nikon, США), анализов метаболической активности (МТT) и колониеобразующих единиц (КОЕ).

Антибиопленочная активность HIFU зависит от времени воздействия, что подтверждено исследованиями. Эффект HIFU против биопленок S. mutans объясняется комбинированным действием акустических микропотоков, микроструй и ударных волн, генерируемых акустическими кавитационными явлениями. Более того, антимикробный эффект HIFU без применения лекарственных препаратов может снизить вероятность развития резистентности, поскольку у бактерий меньше времени на адаптацию к стрессу, создаваемому постоянной механической волной.

Ультраструктурные и кристаллографические изменения

Эмаль БПЭ показала высокопористую поверхность и межпризматические зазоры, возникшие в результате потери кристаллитов ГАП из-за истощения минеральных ионов. Эта картина осталась неизменной, включая шероховатость поверхности, после воздействия HIFU (10 мин) без применения КФИК (HIFU/-NP). Напротив, нанесение КФИК без воздействия HIFU привело к более гладкой поверхности из-за того, что AФК маскировал эффект нижележащего рисунка деминерализованной пористой поверхности, отраженного от пика дифракции рентгеновской дифракции (рис. 3). После комбинированной обработки КФИК/HIFU было отчетливо видно уменьшение поверхностной микропористости, межпризматических зазоров и шероховатости поверхности (S_a) при увеличении времени воздействия до 5 и 10 мин. Восстановление ультраструктуры эмали было очевидным при 5-минутном воздействии HIFU после нанесения КФИК и было сопоставимо со здоровой эмалью ( рис.3. E, G, H, M). Рентгеновская дифракция подтвердила это открытие, выявив отчетливый, острый интенсивный пик дифракции при 2θ° от 15 до 30° (рис.3. O, зеленый спектр), по сравнению с широким пиком низкой интенсивности (рис.3. O, оранжевый спектр), зарегистрированным в группе NP/-HIFU. Это указывает на трансформацию AФК (аморфная фаза) в ГАП (кристаллическая фаза) в образцах эмали, обработанных КФИК с последующим HIFU в течение 5 минут.

(A, A1) Эмаль с необработанным белым пятном (БПЭ) имела высокопористую поверхность и межпризматические зазоры. (B, B1) Эмаль БПЭ, подвергнутая воздействию высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU) в течение 10 минут, продемонстрировала близкое морфологическое сходство с необработанной БПЭ. (C, C1) Применение одних только кластеров ионов фосфата кальция (КФИК) привело к более гладкой текстуре поверхности и образованию слоя покрытия аморфного фосфата кальция (AФК), маскирующего лежащую под ней призматическую и межпризматическую структуру. Эмаль, обработанная КФИК/HIFU в течение 2,5 (D, D1), 5 (E, E1) и 10 мин (F, F1) времени экспозиции соответственно, показала постепенное исчезновение типичной призматической-межпризматической структуры. (G) Здоровая эмаль. (H–N) Соответствующие поперечные изображения образцов эмали. (H) Здоровая эмаль, показывающая четко определенную продольно ориентированную призматическую структуру с плотно упакованными стержнеобразными кристаллитами гидроксиапатита (ГАП), простирающимися до самого внешнего поверхностного слоя. (I) Необработанный БПЭ показал бесструктурный, пористый, неорганизованный поверхностный слой без определенной ориентации. Более или менее схожие морфологические особенности с необработанным БПЭ (I) были обнаружены после воздействия только HIFU (J), применения только КФИК (K) и воздействия КФИК/HIFU в течение 2,5 мин (L). Четко определенная продольно ориентированная призматическая структура, имеющая стержнеобразный морфологический вид, наблюдалась при воздействии HIFU в течение 5 мин (M) и 10 мин (N) после нанесения КФИК. В частности, КФИК с последующим воздействием HIFU в течение 5 мин обработки (M) продемонстрировали непрерывное организованное линейное коаксиальное расположение плотно упакованных кристаллитов ГАП. (O) Спектральный анализ рентгеновской дифракции (XRD) образцов эмали. Синий спектр представляет собой необработанный БПЭ (DE). Образцы, обработанные только КФИК (оранжевый спектр), показали образование аморфного слоя AФК, отраженного от широкого горба на картине XRD в положении 15–30,15° 2θ (вставка). Однако после последующего воздействия HIFU в течение 5 мин (зеленый спектр) повторное появление острого пика в том же положении 2θ предполагало превращение аморфного AФК в кристаллический ГАП. (P) Среднее значение шероховатости (S _a ), показывающее постепенное уменьшение шероховатости поверхности с увеличением времени воздействия HIFU (полосы погрешности представляют собой стандартное отклонение; разные буквы указывают на статистические различия).

Важно понимать, что сохранение долговременной целостности восстановленной эмали представляет собой сложную задачу из-за постоянных эпизодов деминерализации/реминерализации, на которые влияют различные факторы. Поэтому предполагается, что реминерализацию с помощью КФИК/HIFU необходимо будет дополнять регулярной гигиеной полости рта. Как и при любом лечебном вмешательстве, рецидив любого поражения зависит от ряда клинических факторов. Поэтому лечение рецидива бпэ и/или появления новых поражений, которые могут потребовать повторного вмешательства, индивидуальны и должны рассматриваться как часть комплексного плана лечения пациента, включая фазу поддерживающей терапии.HIFU — это неионизационная доступная технология, получившая несколько одобрений. В настоящее время рассматривается установка миниатюрных преобразователей на портативные устройства, такие как внутриротовые сканеры, с набором сменных наконечников, имеющих различные углы наклона. Кроме того, матричные преобразователи в настоящее время используются для приложений, требующих множественного воздействия HIFU на несколько поражений одновременно. Это способствует созданию устройств, которые аналогичны секционным оттискным ложкам, имеющим набор установленных микроматричных преобразователей, которые облегчают доставку HIFU не только в разные места на зубе, но и на несколько зубов одновременно.